虽然目前生物有机肥产品生产菌种大多采用植物根际促生菌, 但近年来很多研究发现,芽孢菌属和类芽孢菌个别菌株能产生菌素。 即便在菌种安全分级目录中列为一级免做理学试验的菌种, 如枯草芽孢菌、 多类芽孢菌、 地衣芽孢菌等个别菌株也检测到部分溶血素基因, 潜在危害不容忽视。 因此, 开展生物有机肥产品生产菌种生物安全风险评价, 从源头上把好菌种安全关是产品安全的首要保障。通过---发现, 用于生物有机肥产品的部分生产菌种分类---不明确, 甚至混乱,低温生物菌种报价, 难以从源头上进行安全风险的初步识别 。 以常见生产菌种枯草芽孢菌为例, 实际上是一个表型相似的群体, 包括枯草芽孢菌、 地衣芽孢菌、 短小芽孢菌、解淀粉芽孢菌、 深褐 (萎缩) 芽孢菌、莫哈韦(莫杰夫) 芽孢菌、 死谷芽孢菌、 索诺拉沙漠芽孢菌、 特基拉芽孢菌、暹罗芽孢菌等 10个缘种。生产企业送检的枯草芽孢菌生物有机肥产品, 经鉴定发现很多产品实际为解淀粉芽孢菌, 且许多菌株具有很强的溶血作用。通过对生产企业---发现, 部分生产企业选择分离于动物肠道的解淀粉芽孢菌作为产品生产用菌株, 该类菌种生产发酵周期短、 活菌数量高、 生产成本低, 但产品的应用功效不佳, 溶血风险大 , 建议慎用。而植物来源的解淀粉芽孢菌溶血风险小,低温生物菌种价格, 产品应用效果好, 使用。
(1)准备安瓿管用于冷冻干燥菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造,形状可用长颈球形底的,亦称泪滴型安瓿管(图ⅶ-15),大小要求外径6-7.5mm,长105mm,球部直径9-11mm,壁厚0.6-1.2mm。也可用没有球部的管状安瓿管。塞好棉塞,1.05kg/cm2>;,121.3℃灭菌30分钟,备用。
(2)准备菌种,用冷冻干燥法保藏的菌种,其保藏期可达数年至十数年,低温生物菌种公司,为了在许多年后不出差错,故所用菌种要---注意其纯度,即不能有杂菌污染,然后在适培养基中用适温度培养,使培养出---的培养物。---和酵母的菌龄要求超过对数生长期,低温生物菌种,若用对数生长期的菌种进行保藏,其存活率反而降低。一般,---要求24-48小时的培养物;酵母需培养3天;形成孢子的微生物则宜保存孢子;线菌与丝状---则培养7-10天。
(3)制备菌悬液与分装以---斜面为例,用脱脂牛乳2ml左右加入斜面试管中,制成浓菌液,每支安瓿管分装0.2ml。
(4)冷冻冷冻干燥器有成套的装置出售,价值昂贵,此处介绍的是简易方法与装置,可达到同样的目的。
将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻,无低温冰箱可用冷冻剂如干冰(固体co2>;)酒精的液或干冰酮液,温度可达-70℃。将安瓿管插入冷冻剂,只需冷冻4-5分钟,即可使悬液结冰。
将培养成熟的斜面孢子制成悬浮液,接种到扁瓶固体培养基上,于25~28℃培养14天。将成熟的扁瓶孢子于真空中抽干,使水分降至10%以下,并放入 4℃冰箱中备用。一次制得的孢子瓶可在生产上延续使用半年左右。放线孢子的培养基大多是采用麸皮或豌豆浸出液、---及无机盐与琼脂制成的。将斜面孢子接入扩大的扁瓶孢子培养基中,于28~37℃培养5~14天。所获得的大量孢子可直接作为种子罐 (6)的种子。如果有些生产菌种不产孢子,如赤霉产生菌或产孢子不多的,则可采用摇瓶(5)液体培养制得菌丝体,作种子罐的种子。种子罐的目的是使接入有限的孢子或菌丝体迅速发芽、生长、繁殖成大量菌体。其中的培养基组分应是易于被菌体利用的碳源(如---)和氮源(如玉米浆等),及无机盐(如磷酸盐)等。作为发酵罐(7)的种子应是生命力旺盛、染色深、菌丝粗壮,无杂菌及异常菌体。接种量一般在10%~20%。
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