1 沙土管制备
将河沙用60目过筛,弃去大颗粒及杂质,再用80目过筛,去掉细沙。用吸铁石吸去铁质,放入容器中用10%---浸泡,如河沙中有机物较多可用20%---浸泡。24小时后倒去---,用水洗泡数次至中性,将沙子烘干或晒干。另取地面下40~60cm非耕作层贫瘠且粘性较小的土,研碎,100目过筛,水洗至中性,烘干。将处理后的沙、土按比2∶1混合。混匀的沙土分装入安瓿管或小试管中,高度为1cm左右,塞好棉塞,121℃湿热灭菌30min。随机抽取灭菌后的砂土管若干支,低温生物菌种厂家,无菌条件下取少许砂土至营养肉汁培养基中,30℃培养24小时,检查无微生物生长后方可使用。
2 斜面培养物的制备
参照定期移植法。
3 制备菌悬液
向培养好的斜面培养物中注入3~5ml无菌水,洗下细胞或孢子制成菌悬液。用无菌吸管吸取菌悬液,均匀滴入沙土管中,每管0.2~0.5ml。霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。
4 干燥
真空抽去沙土管中水分。
5 保藏
将沙土管用火焰熔封后存放于低温(4~6℃)干燥处保藏,每隔半---查一次菌种存活性及纯度。或将沙土管直接用牛皮纸或塑料纸包好,置干燥器内保存。
保藏时间2~10年。
6 恢复培养
无菌条件下打开沙土管,取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上,长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养基中,增殖培养后再转接斜面。
(1)选择培养成熟的(一般指孢子层生长---的,营养细胞用此法效果不好)优良菌种,以无菌水洗下,制成孢子悬液。
(2)于每支沙土管中加入约0.5ml(一般以---使沙土润湿为宜)孢子悬液,以接种针拌匀。
(3)放入真空干燥器内,用真空泵抽干水分,抽干时间越短越好,务使在12小时内抽干。
(4)每10支抽取一支,低温生物菌种,用接种环取出少数沙粒,接种于斜面培养基上,进行培养,观察生长情况和有无杂菌生长,如出现杂菌或菌落数很少或---不长,低温生物菌种报价,则说明制作的沙土管有问题,尚须进一步抽样检查。
(5)若经检查没有问题,用火焰熔封管口,放冰箱或室内干燥处保存。每半---查一次活力和杂菌情况。
(6)需要使用菌种,---培养时,取沙土少许移入液体培养基内,低温生物菌种,置温箱中培养。
此法多用于能产生孢子的微生物如霉菌、,因此在工业生产中应用广,效果亦好,可保存2年左右,但应用于营养细胞效果不佳。
此方法是很常用的,广泛适用于---、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。
此方法的缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力,保藏期短,传代次数多,菌种较容易发生变异和被污染。
正常情况下的保菌期:霉菌和有芽孢的---一般可保存6个月左右,无芽孢的---可保存1个月左右,酵母菌可保存3个月左右。
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